从水中提取氧气的能力，以及心脏驱动组织氧气运输的能力，是鱼类重要生活史性能特征的基本决定因素。心脏功能反过来又依赖于心脏自身的氧气供应，在一些硬骨鱼类中，部分氧气供应是通过直接起源于鳃的冠状循环来输送的，这种冠状循环会为心脏供血，并且对心脏、代谢和运动能力至关重要。然而，目前尚不清楚的是，受损的鳃血流量（例如，因垂钓导致鱼钩对鳃造成的损伤），限制了氧气摄取和冠状血流量，会如何影响鱼类对能量需求很高的亲代抚育行为和繁殖适合度。在这里，我们检验了这样一个假设，即阻断四分之一的鳃血流量并消除冠状血流量会对雄性小嘴黑鲈（Micropterus dolomieu）的亲代抚育行为、心脏功能（通过植入的 Star-Oddi 心率记录仪记录的心率指标）和繁殖适合度产生负面影响。我们的研究结果表明，鳃 / 冠状动脉结扎损害了繁殖适合度，这体现在与假手术对照组鱼类相比，能够长到自由游动幼鱼阶段的鱼卵比例更低，且弃巢率有升高的趋势。虽然这与结扎鱼的攻击性有降低的趋势相关，但亲代抚育行为在很大程度上并未受到结扎的影响。此外，结扎并未损害任何心率性能指标。我们的研究结果强调营口股票配资，在产卵季节，鳃损伤可能会损害小嘴黑鲈种群的繁殖产出。然而，这一发现背后的机制仍然不清楚。

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一、引言

一些鱼类物种已经适应了进行亲代抚育行为，因为这能提高繁殖适合度。其中一个这样的物种是小嘴黑鲈，这种鱼从鱼卵阶段到幼鱼能够自由游动期间都会照顾它们的后代，而且亲代抚育工作是由雄性承担的（这种模式在许多硬骨鱼类中都能观察到）。雄性的抚育行为包括通过用鳍主动扇动鱼卵或幼鱼来照料正在发育的后代，使它们保持有充足的氧气并且没有杂物，同时还要守护并积极保护鱼卵免受捕食者的侵害。在亲代抚育期间，雄性黑鲈每天可能会游动长达 45 至 60 千米来驱赶捕食者，同时还会待在离巢穴较近的地方（约 3 米）。因此，可以推测小嘴黑鲈的雄性亲代行为是一项在代谢方面具有挑战性的任务，因为在这个时期鱼可能会大幅限制进食，所以这是在有限的能量储备下进行的。

小嘴黑鲈是垂钓者喜爱的目标鱼类，而且在亲代抚育期间其加剧的攻击性增加了它们被钓到的可能性。尽管大多数黑鲈（超过 90%）会被放生，但钓鱼可能会导致各种伤害以及行为和生理上的改变。虽然从巢穴中捕获鱼几乎肯定会导致繁殖失败，但一次捕获后再放生的事件也可能会对雄性保卫其巢穴的能力产生负面影响，这可能会导致弃巢、鱼卵孵化成功率降低，从而降低繁殖适合度。捕获后再放生的钓鱼方式的一个潜在负面影响在很大程度上尚未被探究，那就是鱼钩对鳃造成的损伤是否会以及在多大程度上影响雄性黑鲈的亲代抚育行为或生理能力。这种损伤会发生在多种鱼类身上，包括黑鲈属的鱼类，例如大口黑鲈。除了鱼钩造成的损伤外，黑鲈的鳃在处理过程中或在使用手指或摘钩器（例如钳子）摘钩时，或者在使用如通过鳃盖固定鱼的绳串等保活器具时，也可能会被垂钓者弄伤。鳃损伤或通过一个或几个鳃弓（每个鳃弓占鳃总表面积的八分之一）阻断鳃部血流可能会损害鳃部的氧气摄取能力以及整体的循环氧气运输能力，例如，正如之前在鳃弓被结扎或受到物理损伤的虹鳟鱼中所报道的那样。此外，对第二对鳃弓的特定损伤也会损害心脏的氧气供应，因为小嘴黑鲈和其他一些硬骨鱼类物种（例如鲑科鱼类）一样，其冠状循环起源于第二对鳃弓（个人观察）。然而，据我们所知，一个或几个鳃弓的损伤是否会影响鱼类的亲代抚育或心脏功能尚不清楚。此外，小嘴黑鲈的心脏在多大程度上依赖于通过冠状循环的血液供应来维持心脏功能或整个动物的性能特征，目前也尚未被探究。

心脏驱动血液流动从而为组织输送氧气的能力是有氧代谢能量产生的一个关键决定因素，而有氧代谢能量产生又决定了有氧代谢范围以及进行持续或重复身体活动的能力。心输出量，即心脏在单位时间内产生的总血流量，是心率和每搏输出量的乘积。已知小嘴黑鲈和大口黑鲈在需要增加组织氧气供应的情况下，例如在短暂的运动期间以及运动恢复期间（小嘴黑鲈在其亲代抚育期间经常会有这样的运动），主要通过 “频率调节” 来调节心输出量。因此，记录心率很可能是衡量小嘴黑鲈代谢性能和代谢范围的一个良好指标。例如，研究人员们（2019 年）使用通过手术植入的心率记录仪（DST milli HRT，Star-Oddi，冰岛加尔达拜尔）评估了筑巢黑鲈的心率指标。虽然他们没有发现雄性小嘴黑鲈的心率性能指标和亲代抚育行为之间有任何显著关系，但他们确实发现心率与鱼的攻击性水平呈正相关。然而，目前尚不清楚受损的鳃部氧气摄取能力和心脏氧气供应的受损情况是否会以及在多大程度上影响心脏性能（正如下面所概述的，冠状结扎会对心脏性能产生负面影响）与黑鲈（即研究人员们在 2019 年评估的指标）或一般鱼类的亲代抚育行为和适合度之间的关系，因此这是当前研究的探究主题。

心脏功能依赖于心脏自身的氧气供应，在所有鱼类中，氧气主要是通过使内部海绵状心肌充氧的静脉血来输送的（即腔内供应）。然而，一些硬骨鱼类物种也有冠状循环，能将完全充氧的动脉血从鳃直接输送到心脏的外部致密层。当鱼类面临环境或身体挑战，导致心肌需氧量增加和 / 或腔内氧气供应受限的时候，冠状循环就会发挥主要作用。例如，在鲑科鱼类中，心脏约 20% 至 60% 由致密心肌组成，在运动期间、急性升温时以及缺氧状态下，冠状血流量会增加。在静止状态下的虹鳟鱼中，通过结扎冠状动脉来实验性地阻断心脏的冠状供应会降低每搏输出量，而由于心率的代偿性升高，常规的心输出量仍能维持。此外，正如在植入了 Star-Oddi 心率记录仪的虹鳟鱼中所证明的那样，心率范围（最大（活动时）心率 - 静息心率）以及最大代谢率和有氧代谢范围在冠状动脉结扎后会显著降低。冠状动脉结扎还会降低奇努克鲑的最大持续游泳速度，并降低虹鳟鱼对急性环境升温以及缺氧的耐受性。因此，虽然很明显冠状循环在鲑科鱼类的整体动物性能和环境耐受性方面起着至关重要的作用，但到目前为止还没有研究评估过心脏的冠状供应是否会影响与鱼类繁殖适合度直接相关的特征。此外，之前大多数研究冠状循环相关性的研究都是在鲑科鱼类中进行的，而在其他具有冠状循环的硬骨鱼类物种（例如小嘴黑鲈）中进行的类似研究在很大程度上仍未开展。

在当前的研究中，我们通过实验性地阻断来自小嘴黑鲈冠状动脉起源处（即第二对鳃弓）的血流（即鳃部 / 冠状动脉结扎），研究了潜在的鳃血管损伤（例如在捕获后再放生的钓鱼活动之后）对雄性小嘴黑鲈的心脏功能、亲代抚育行为和繁殖成功率的影响。我们还为一部分鱼安装了心率生物记录仪，以记录自由游动的鱼在其亲代抚育期间的心率。我们假设鳃部 / 冠状动脉结扎会导致静息心率升高（表明每搏输出量受损）和心率范围降低，并且结扎的鱼保卫或照料鱼卵的能力会受到损害，从而由于鱼卵存活率降低和弃巢发生率升高而导致繁殖适合度降低。

二、材料与方法

以下描述的实验于 2017 年 5 月 13 日至 6 月 6 日在加拿大安大略省的里多河流域进行。鱼类采集是依据安大略省自然资源与林业部颁发的 FMZ 18 科学采集许可证（编号：1079390）进行的。以下描述的所有实验程序均得到了卡尔顿大学动物护理委员会颁发的动物护理协议（BT-026）的批准。

01. 研究动物、研究地点和巢穴位置的确定

我们在奥皮尼孔湖（北纬 44.5600°，西经 76.3278°）、印第安湖（北纬 44.5930°，西经 76.3265°）和桑德湖（北纬 44.5678°，西经 76.2636°）中研究了不同年龄和体型的雄性亲代小嘴黑鲈（M. dolomieu，n = 73）。这三个湖泊通过运河系统相互连接，因此在许多方面可看作一个单一的系统。巢穴位置由潜水员确定和评估，方法如先前所述。简而言之，由筑巢雄性占据的巢穴位置是根据鱼卵数量（或鱼卵评分，评分范围为 1 到 5 ）来评定的。鱼卵评分为 1 到 2 表示鱼卵稀少且稀疏地分布在筑巢地点，其中评分为 1 表示鱼卵覆盖的面积比评分为 2 时更小。鱼卵评分为 3 表示一个普通的巢穴，有许多鱼卵散布在整个巢穴中，有些区域的鱼卵稍微密集一些。评分为 4 表示一窝鱼卵数量很多且密集排列，覆盖了巢穴的很大一部分区域，评分为 5 表示整个巢穴的鱼卵密度都非常高。仅使用鱼卵评分达到 3 分或更高的巢穴，因为已知这些评分能降低雄性弃巢的可能性。鱼类大小和鱼卵评分指标见表 1。

表1. 雄性小嘴黑鲈（Micropterus dolomieu）的体长及其巢穴的评分。鱼卵评分范围从 1（鱼卵数量少）到 5（数千枚鱼卵）。对于这两个变量，各处理组之间没有统计学显著差异（P ≤ 0.05）。

02. 鱼类捕获和手术程序

在实验方案的第一天，使用人工鱼饵通过垂钓的方式在鱼类的巢穴处捕获鱼。在巢穴旁的潜水员会引导垂钓者，潜水员通过手势将鱼的行为传达给垂钓者，以方便垂钓并确保鱼钩能快速且表浅地钩住鱼。使用带橡胶的捕捞网将鱼捞上船，并立即将其放置在手术台上。使用接触鱼吻部和尾柄的鱼类处理手套（10 毫安）进行电麻醉使鱼固定，在随后的手术过程中，用充氧的湖水持续冲洗鱼鳃（见下文）。

一部分鱼（从现在起称为 “心率记录仪鱼”）安装了心率和温度记录仪（DST milli HRT，Star-Oddi，冰岛加尔达拜尔）。通过在腹鳍和胸鳍之间约 3 至 5 厘米的切口将记录仪插入腹腔，并将其垂直放置在心包壁后方。使用 3–0 缝线（PDS II 聚二氧六环酮单丝缝线）将记录仪固定在腹部腹侧肌肉上。然后使用 4 到 5 个方结缝线（3–0，PDS II 聚二氧六环酮单丝缝线）缝合切口。另一部分鱼（“非记录仪鱼”）没有植入心率记录仪，而是在捕获后立即按照以下描述进行处理。

非记录仪鱼和心率记录仪鱼处理组中的鱼随后都被分成两个新的组。在其中一组（鳃部 / 冠状动脉结扎组）中，将两段编织钓鱼线（0.35 毫米，间隔约 1 厘米放置）放置在两侧整个第二鳃弓的鳃耙和鳃丝之间（见图 S1，可在线获取），在这种鱼中，鳃下动脉和冠状动脉就起源于此（个人观察）。将编织线系紧以限制通过鳃弓的鳃部血流，从而限制鳃下动脉和冠状动脉的血流，进而确保阻断流向心脏的冠状动脉血流。在第二组（假手术组）中，触摸并操作鳃弓以模拟结扎程序，但该组中没有在鳃弓周围系编织线。假手术（平均：8 分钟（´）24 秒（´´），± 标准差：2 分 18 秒）和冠状动脉结扎程序（平均：8 分 06 秒，± 标准差：1 分 54 秒）的手术时间之间没有显著差异（P > 0.05，t 检验）。记录鱼的全长以表示鱼的大小（精确到毫米），然后将鱼放生在巢穴附近。在进行手术的时间里，潜水员通过在巢穴上方临时放置一个铁丝网罩来保护巢穴免受捕食者（主要是蓝鳃太阳鱼、岩鲈、南瓜籽太阳鱼以及小嘴黑鲈和大口黑鲈）的侵害。在放生雄性亲代鱼后，潜水员移走网罩并监测鱼返回巢穴的情况，通常鱼会在 1 至 3 分钟内返回。

对安乐死的鱼（n = 4）进行的初步实验表明，结扎成功地阻断了结扎部位的血流。在安乐死之后，立即向鱼的尾血管注射生理盐水（含肝素（5000 国际单位每毫升）的 0.9% 氯化钠溶液）以防止血液凝固。将一种有色硅胶铸型材料注入鳃下动脉（该动脉源于鳃部循环且冠状动脉由此起源）以逆行（逆流）方向朝鳃部循环注入，这表明没有液体通过结扎部位。此外，还向鳃下动脉下游（即朝向心脏方向）注射以确保小嘴黑鲈（以及大口黑鲈）中存在为心脏供血的冠状循环。

03. 行为监测与评估

在实验方案的第二天，潜水员将一台安装在约 30 厘米高支架上的 GoPro 相机（HERO 3 或 5）放置在靠近巢穴（约 1 米）的位置，以记录黑鲈的行为至少 1 小时，之后取回相机。在第三天重复此过程，然而，这一次在大约 50 分钟后，将一个装有巢穴捕食者（即南瓜籽太阳鱼；体长：约 130 至 150 毫米，详见下文）的 4 升透明玻璃罐放置在巢穴周边的外边缘且在相机视野内，放置 10 分钟，之后取回相机和玻璃罐。

使用 BORIS 软件（版本 6.2.2 ）进行行为分析。行为评估从相机放置在巢穴处 20 分钟后开始，在第二天和第三天都记录 20 分钟的行为。在此期间，评估鱼在以下三种行为中任何一种上所花费的时间：i）照料巢穴，通过扇动鱼卵或清除巢穴区域的杂物来照料鱼卵或巢穴；ii）守护巢穴，在巢穴上方盘旋（有时背鳍竖起）或在巢穴附近游动；iii）追逐，积极地将捕食者从巢穴赶走。然后将守护巢穴的总时间计算为守护巢穴和追逐行为所花费时间的总和。在第三天暴露于捕食者（即罐中的南瓜籽太阳鱼）期间，记录撞击玻璃罐的次数（即嘴撞击玻璃罐）以及威胁性展示的次数（即打哈欠，鱼向玻璃罐张开嘴）。将撞击次数和打哈欠次数的总和确定为攻击性评分。还记录从放置玻璃罐到首次出现攻击性行为的时间。在 20 分钟的行为评估期间以及暴露于捕食者期间，记录自然出现的捕食者（同种或其他物种）的数量。

04. 鱼类重新捕获、最大心率评估和记录仪移除

在第四天，使用心率生物记录仪的两个实验组的鱼通过在潜水员协助下从船上使用人工鱼饵进行常规垂钓，或由潜水员进行水下垂钓的方式重新捕获。鱼被立即放生到船上一个直径 90 厘米、高 30 厘米、装有约 115 升湖水的圆形水池中。随后让鱼进行 3 分钟的追逐实验方案以引出最大心率，在此期间通过小心地戳鱼的尾柄和鱼鳍来促使鱼游动。然后将鱼放置在一个装有湖水的冷却箱（66 * 34 * 31 厘米，70 升）中进行一小时的追逐后最大心率记录，在此期间多次部分换水以补充水中的氧气水平、去除有害的代谢副产物并保持稳定的水温。然后对安装了心率记录仪的鱼进行第二次手术干预，使用与上述相同的手术设置和电麻醉方法。重新打开腹部的切口，取出心率记录仪，然后使用 4 到 5 个方结缝线（3–0，PDS II 聚二氧六环酮单丝缝线）缝合切口。实验结束后，结扎线保留在原位。然后将鱼放生在其巢穴附近并如上述进行监测。同样，在整个这些程序期间，如先前所述保护巢穴免受捕食者侵害。七只安装了心率记录仪的鱼（5 只假手术组和 2 只结扎组的鱼）在追逐后恢复阶段通过头部敲击的方式实施安乐死，切除心室并将其放置在 70% 的乙醇中储存至少 24 小时，以便随后测定心室致密心肌和海绵状心肌的比例。将心室切成两半，将两层心肌分离并放置在有盖的容器中晾干直至完全干燥，然后按照详细方法称重。

05. 鱼卵发育监测

随后对没有安装心率生物记录仪的两组鱼（即非记录仪鱼）的巢穴进行监测，在首次发现巢穴后的 3 至 14 天内多次由潜水员进行监测（小嘴黑鲈的鱼卵阶段约为 6 天 ），以评估鱼卵的发育情况，直到出现孵化后能自由游动的幼鱼，这表明巢穴繁殖成功。同时也记录雄性是否在巢穴处。

06. 心率记录仪的编程和心率分析

心率记录仪被编程为在手术植入当天的午夜（即第一天和第二天之间的过渡时间）开始采样，每个记录仪被编程为每 2 分钟以 100 赫兹的频率记录 6 秒的心率，并每 1.5 小时记录一次心电图（ECG），随后用于验证心率记录的质量。心率分析仅纳入质量指数（QI）为 0 的数据（QI 范围：0 至 3），因为这确保了使用这些记录仪记录的心率具有较高的准确性和可靠性 。静息心率确定为第 10 个百分位数 ，常规心率计算为在给定数据收集期间获取的数据的平均心率。为了评估手术后心率的恢复情况（以心率下降为指标），分别使用心率数据记录的第一天、第二天和第三天收集的数据来评估静息心率和常规心率（即实验方案的第二天、第三天和第四天，图 S2，可在线获取，见下面的统计部分）。由于发现两组在第四天的静息心率和常规心率均为最低（见图 S2），因此在后续分析中仅使用第四天每个相应处理组的静息心率和常规心率数据。最大心率确定为在追逐实验方案（第四天）或暴露于捕食者期间（第三天）观察到的最高心率。心率范围计算为：最大心率（追逐后） - 静息心率（第四天）。我们还计算了在常规育雏行为期间（第四天）常规心率所利用的心率范围百分比（R% 心率），计算方法为：（常规心率 - 静息心率）/ 心率范围 * 100 。

07. 统计分析

使用 SPSS（版本 25 ）进行统计分析，当 P ≤ 0.05 时认为具有统计学显著性。除非另有说明，数值均以平均值 ± 标准误表示。分别使用夏皮罗 - 威尔克检验（Shapiro-Wilk's test）和莱文检验（Levene's test）来确定数据的正态性和方差齐性。对于不满足这些假设的数据，在进行统计检验前进行转换（对数 10 转换：攻击性评分（非记录仪鱼）和攻击时间（心率记录仪鱼和非记录仪鱼），取反和对数 10 转换：第三天照料 / 保卫巢穴的时间，非记录仪鱼和心率记录仪鱼）。通过独立双尾 t 检验评估处理组之间（即假手术组和鳃部 / 冠状动脉结扎组的鱼）在体长和巢穴鱼卵评分方面的差异。使用单因素协方差分析（One-way ANCOVA）来检验假手术组和鳃部 / 冠状动脉结扎组的鱼在照料巢穴和保卫巢穴行为所花费时间百分比方面的差异。将行为评估期间存在的捕食者数量作为协变量纳入分析。使用双因素重复测量方差分析（Two-way repeated measures ANOVA）来评估时间（第二天至第四天）和处理（假手术组与鳃部 / 冠状动脉结扎组）对手术后静息心率和常规心率恢复的影响。如果检测到显著的交互作用（时间 * 处理），则进行单因素重复测量方差分析（One-way repeated measures ANOVA）以评估时间（第二天至第四天）对各处理组内静息心率和常规心率的影响。通过对各天之间进行两两比较进一步探究处理组内时间的显著影响，并应用邦费罗尼校正（Bonferroni adjustments）来校正多重比较。还使用单因素协方差分析（One-way ANCOVA）来评估温度（协变量，由心率记录仪记录）对追逐后和暴露于捕食者期间的静息心率和最大心率的影响。然而，在所评估的狭窄温度范围内（范围：15.6 至 17.1°C，平均：16.2 ± 0.4°C，图 S3，可在线获取），温度对心率没有显著影响。因此，对于静息心率、常规心率、追逐后和暴露于捕食者期间的最大心率，以及心率范围和 R% 心率的组间差异，改为通过独立双尾 t 检验进行评估。使用皮尔逊相关分析（Pearson's correlations）来评估亲代抚育行为、行为评估期间接近巢穴的捕食者数量、攻击性评分和首次攻击时间以及心率变量之间的关系。使用二项逻辑回归（binominal logistic regression）来评估处理组之间出现能自由游动的幼鱼（即雄性将其鱼卵养育到幼鱼能自由游动的能力）或弃巢（即巢穴处雄性的存在情况）的可能性。在模型中，将幼鱼的存在（是 / 否）或雄性弃巢（是 / 否）作为因变量纳入，将处理（假手术组与鳃部 / 冠状动脉结扎组，分类变量）、鱼的长度（即大小）、位置 / 湖泊（印第安湖或奥皮尼孔湖）、捕食者的平均数量（在行为评估的第一天和第二天评估）或初始鱼卵评分作为自变量。在这五个预测变量中，仅处理对于幼鱼的存在具有显著性，对于弃巢情况接近显著 。然而，该模型对于这两个变量均不显著（χ25 = 5.290；P = 0.382 和 χ25 = 8.966；P = 0.110，分别）。只有在去除除处理之外的所有自变量时，该模型对于幼鱼的存在（χ21 = 4.302；P = 0.038）和雄性弃巢（χ21 = 3.919；P = 0.048）才具有显著性。然而，令人惊讶的是，处理作为这两个变量的预测因子均不显著，但接近显著（分别为 P = 0.051 和 P = 0.070 ）。因此，为了进一步探究这些趋势，我们使用两组比例的卡方检验（Chi-square test of two proportions）来确定假手术组和结扎组的鱼在将其鱼卵养育到幼鱼能自由游动的能力方面是否存在差异（存在能自由游动的幼鱼：是 / 否），并使用费希尔精确检验（Fisher's exact test）来评估各组之间在雄性弃巢数量方面的差异（弃巢：是 / 否）。我们还按照上述方法进行了另一次二项逻辑回归，但这次仅纳入没有弃巢的鱼，以评估假手术组（n = 15）和鳃部 / 冠状动脉结扎组（n = 18）的鱼中出现能自由游动的幼鱼的可能性。

三、结果

来自任何一个研究湖泊的鱼，在体长或巢穴鱼卵评分方面，各群体之间均没有差异（表 1）。在本研究中，雄性小嘴黑鲈（n = 7）的心室由 9.4 ± 0.9% 的致密心肌组成（平均值 ± 标准差，范围从 4.6% 到 12.4%）。

01. 鳃部 / 冠状动脉结扎对亲代黑鲈繁殖适合度的影响

在未安装记录仪的鱼中，与接受假手术的鱼（20 条中有 2 条，占 10%）相比，结扎的雄性有更高的弃巢倾向（23 条中有 8 条，占 35%，P = 0.076）（图 1A）。此外，与接受假手术的鱼所养育的鱼卵（20 条中有 14 条，占 85%）相比，由结扎的雄性所养育的鱼卵，成功发育到幼鱼自由游动阶段的数量显著更少（23 条中有 13 条，占 57%，χ21 = 4.113；P = 0.043，图 1B）。在鳃部 / 冠状动脉结扎的鱼中，15 条未弃巢的雄性中有 2 条（占 13.3%）未能将其鱼卵养育到幼鱼自由游动阶段，而接受假手术的鱼中，18 条中有 1 条（占 5.6%）未能成功。然而，二项逻辑回归中纳入的预测变量，均没有显著地解释雄性将其后代养育到幼鱼自由游动阶段的可能性（χ25 = 7.017；P = 0.219）。

图1. 鳃部和冠状动脉结扎对雄性小嘴黑鲈（Micropterus dolomieu）弃巢百分比以及将其鱼卵养育到幼鱼自由游动阶段能力的影响。接受假手术（红色符号，n = 20）和鳃部及冠状动脉结扎（蓝色符号，n = 23）的雄性小嘴黑鲈中，雄性弃巢的百分比（A）和发育到幼鱼自由游动阶段的鱼卵百分比（B）。组间差异通过费希尔精确检验（A）或两组比例检验（B）确定。星号（*）表示组间具有统计学显著差异（P ≤ 0.05）。

02.鳃部 / 冠状动脉结扎对雄性小嘴黑鲈亲代抚育行为的影响

在未安装记录仪的鱼中，照料巢穴和保卫巢穴所花费时间的百分比，均显著受到接近巢穴的捕食者数量的影响（图 2A、B，表 2）。各群体的鱼大部分时间都用于照料巢穴的行为，这与捕食者的数量呈负相关。剩余的时间则用于保卫巢穴，这与捕食者的数量呈正相关。在第二天，观察到鳃部 / 冠状动脉结扎的鱼和接受假手术的鱼之间存在一个微弱的差异趋势（P = 0.149，图 2A），然而，在第三天没有观察到这样的趋势（图 2B）。

图2. 鳃部 / 冠状动脉结扎对雄性小嘴黑鲈（Micropterus dolomieu）亲代抚育行为的影响。在 20 分钟时间窗口内的照料巢穴和保卫巢穴行为（A，第二天；B，第三天），以及在暴露于巢穴捕食者（南瓜籽太阳鱼，Lepomis gibbosus，第三天）5 分钟期间的首次攻击时间（C）和攻击性评分（D），接受假手术（红色符号，实线，第二天 n = 14，第三天 n = 16）和鳃部 / 冠状动脉结扎（蓝色符号，虚线，第二天 n = 15，第三天 n = 18）的雄性小嘴黑鲈。单因素协方差分析（协变量：捕食者数量）的统计细节显示在 A 和 B 图中，显著结果（P ≤ 0.05）以粗体文本突出显示。通过独立双尾 t 检验评估，处理组之间在 C 和 D 图的变量方面没有统计学显著差异。所描绘关系的线性方程详细列于表 2。

表2. 鳃部 / 冠状动脉结扎和接受假手术的雄性小嘴黑鲈（Micropterus dolomieu）中，亲代抚育行为与鱼卵捕食者数量之间关系的线性方程。在与捕食者互动期间（即罐中的南瓜籽太阳鱼），处理组之间在平均首次攻击时间方面没有统计学显著差异（分别为 27.0 ± 8.8 秒和 12.8 ± 4.6 秒，图 2C），平均攻击性评分方面也没有差异（分别为 22.9 ± 3.7 次和 27.2 ± 3.6 次攻击行为，图 2D）。

03. 鳃部 / 冠状动脉结扎对安装了心率记录仪的雄性黑鲈亲代抚育行为的影响

安装了心率记录仪的鱼，在照料巢穴和保卫巢穴行为所花费时间的百分比方面，呈现出与未安装记录仪的鱼相似的模式，即在第二天和第三天，分别与捕食者数量呈负相关和正相关（图 3A、B，表 2）。同样，行为与捕食者数量之间的线性关系在第二天也比第三天更为明显。再次强调，处理组之间在任何行为方面都没有差异。

图3. 鳃部 / 冠状动脉结扎对安装了心率记录仪的雄性小嘴黑鲈（Micropterus dolomieu）亲代抚育行为的影响。在 20 分钟时间窗口内的照料巢穴和保卫巢穴行为（A，第二天；B，第三天），以及在暴露于巢穴捕食者（南瓜籽太阳鱼，Lepomis gibbosus，第三天）5 分钟期间的首次攻击时间（C）和攻击性评分（D），接受假手术（红色符号，实线，第二天 n = 12；第三天 n = 12）和鳃部 / 冠状动脉结扎（蓝色符号，虚线，第二天 n = 10，第三天 n = 10）并安装了心率记录仪（Star-Oddi）的雄性小嘴黑鲈。单因素协方差分析（协变量：捕食者数量）的统计细节显示在 A 和 B 图中，显著结果（P ≤ 0.05）以粗体文本突出显示。通过独立双尾 t 检验评估，处理组之间在 C 和 D 图的变量方面没有统计学显著差异。所描绘关系的线性方程详细列于表 2。

结扎的鱼和接受假手术的鱼在首次攻击时间方面存在一个差异趋势（分别为 23.3 ± 5.4 秒和 11.6 ± 2.4 秒，P = 0.11，图 3C），然而，在攻击性评分方面，组间未观察到差异（分别为 31.2 ± 4.5 次和 34.7 ± 5.0 次攻击行为，图 3D）。

04. 鳃部 / 冠状动脉结扎对安装了心率记录仪的亲代黑鲈心率性能的影响

在任何心率变量方面，鳃部 / 冠状动脉结扎的鱼和接受假手术的鱼之间均没有统计学显著差异（图 4A - F）。结扎的鱼的平均静息心率为 24.0 ± 1.4 次 / 分钟，接受假手术的鱼为 25.8 ± 1.7 次 / 分钟；结扎的鱼的平均常规心率为 30.9 ± 1.5 次 / 分钟，接受假手术的鱼为 32.3 ± 1.8 次 / 分钟（图 4A、B）。追逐后的平均最大心率，结扎的鱼为 70.5 ± 3.7 次 / 分钟，接受假手术的鱼为 67.5 ± 2.6 次 / 分钟；暴露于捕食者期间的最大心率，结扎的鱼为 57.4 ± 3.0 次 / 分钟，接受假手术的鱼为 64.7 ± 2.9 次 / 分钟（图 4C、D）。鳃部 / 冠状动脉结扎的鱼的心率范围为 47.4 ± 3.0 次 / 分钟，接受假手术的鱼为 41.7 ± 3.1 次 / 分钟（图 4E）。心率范围中的常规心率百分比（R% 心率），鳃部 / 冠状动脉结扎的鱼为 14.8 ± 3.0%，接受假手术的鱼为 15.9 ± 1.7%（图 4F）。任何心率变量与鱼的大小之间，以及与任何亲代抚育行为之间，均没有显著相关性。图 4. 鳃部 / 冠状动脉结扎对雄性小嘴黑鲈（Micropterus dolomieu）心率反应的影响。静息心率（A）、常规心率（B）、追逐后的最大心率（C）、在暴露于玻璃罐中的巢穴捕食者（南瓜籽太阳鱼，Lepomis gibbosus）5 分钟期间的最大心率（D）、心率范围（E，追逐后的最大心率 - 静息心率），以及心率范围中的常规心率百分比（F），接受假手术（红色符号，n = 11）和鳃部及冠状动脉结扎（蓝色符号，n = 10）并安装了心率和温度记录仪的雄性小嘴黑鲈。通过独立双尾 t 检验评估，处理组之间在任何变量方面均没有统计学显著差异（P ≤ 0.05）。

四、讨论

在本研究中，我们评估了对第二对鳃弓进行鳃部结扎，对雄性小嘴黑鲈的亲代抚育行为、心率性能指标以及繁殖适合度的影响。与我们的假设一致，阻断四分之一的鳃部血流，以及通过冠状动脉流向心脏的血流，对繁殖适合度产生了负面影响，结扎的雄性所养育的鱼卵，发育到幼鱼自由游动阶段的数量更少。反过来，这与结扎的雄性相比接受假手术的鱼有更高的弃巢倾向相关（有关这些变量的统计分析方法的完整披露，请参阅方法部分）。在没有弃巢的雄性将其鱼卵养育到幼鱼自由游动阶段的能力方面，各群体之间没有差异。此外，繁殖适合度的降低与这里所评估的结扎对亲代抚育行为的任何显著影响都无关，因此与我们的假设相反。然而，值得注意的是，在未安装记录仪的鱼的首次行为评估（即实验方案的第二天）中，观察到结扎的鱼和接受假手术的鱼之间存在一个差异趋势（即 P = 0.149，见表 2），这表明与接受假手术的鱼相比，结扎的黑鲈对捕食者的攻击性较低，并且在照料巢穴行为上花费的时间更多。一些结扎的鱼攻击性较低的这种趋势，有可能导致在第二天鱼卵被捕食的情况增加，进而减少了鱼卵数量（即鱼卵评分）。确实，已知表现出对幼鱼进行亲代抚育的硬骨鱼类，其亲代抚育投入决策会受到鱼卵数量变化的影响 。例如，实验性地减少鱼卵数量导致小嘴黑鲈对鱼卵的防御减少 ，并且增加了小嘴黑鲈和大口黑鲈弃巢的可能性 。虽然对于确实弃巢的结扎鱼和接受假手术的鱼来说，初始鱼卵数量（即第一天的数量）与弃巢之间没有明显的联系（平均鱼卵评分分别为 4.1 ± 0.8 和 3.4 ± 0.5（平均值 ± 标准差）），但也有可能在当前实验方案期间或之后的某个其他时间点，鱼卵数量发生了变化，这可能触发了一些雄性弃巢。

第二天攻击性降低这一趋势背后的因果机制（这一发现应谨慎解释，因为它在统计学上不显著）仍然未知，但可能反映出鳃部 / 冠状动脉结扎减少了鳃部的氧气摄取，进而降低了有氧能力，这可能损害了驱赶捕食者的能力。确实，通过结扎阻断一个或几个鳃弓的血流（通过结扎），降低了虹鳟鱼动脉血的氧分压 。此外，研究人员发现，虽然对虹鳟鱼第一和 / 或第二鳃弓的鳃损伤在静止状态下不会显著影响其标准耗氧率，但它确实损害了最大耗氧率以及临界游泳速度（Ucrit），这表明鳃损伤在高有氧需求时期可能是有害的。结扎的鱼在第二天攻击性降低的趋势，也可能与这里未评估的其他因素有关，例如，结扎后应激反应加剧（即由结扎手术本身或结扎的生理效应导致）。例如，研究人员表明，实验性地升高应激激素皮质醇水平（通过体腔植入）降低了雄性小嘴黑鲈的游泳活动（爆发性游泳，例如在驱赶捕食者时），并认为亲代抚育投入的这种减少可能会对该物种的适合度产生负面影响。确实，实验性地升高皮质醇水平也已被证明会增加大口黑鲈弃巢的可能性 ，并降低雄性小嘴黑鲈的巢穴成功率 。因此，结扎的鱼中观察到的攻击性降低的趋势，有可能与第二天皮质醇水平升高有关，并且 / 或者这可能导致了该组巢穴成功率降低。然而，在第三天攻击性降低的趋势消失了，并且在未安装记录仪的鱼中，处理组之间在与引入的罐中巢穴捕食者的互动方面没有差异。因此，结扎对引发应激反应的任何潜在影响，或者与损害鳃部氧气摄取或循环氧气运输能力相关的影响，到第三天显然已经消退。在后一种情况下，这可能反映出已经引发了一些措施来补偿氧气摄取和 / 或运输的下降，例如，通过增加循环红细胞的数量（例如，通过红细胞生成或脾脏释放红细胞）来增加血液的氧气运输能力，从而增加血红蛋白含量，这在鱼类中是可能发生的，例如在应激期间 / 之后 。

在行为评估的任何一天，安装了心率记录仪的鱼，其亲代行为在各群体之间没有差异。这与未安装记录仪的鱼在第二天攻击性降低的趋势形成对比，其原因尚不清楚。然而，当结扎的鱼面对罐中的巢穴捕食者时，存在反应时间（即攻击时间）变慢的趋势。虽然这可以被解释为结扎的鱼相对于接受假手术的鱼攻击性降低，但这在随后与捕食者互动的行为中并未体现出来。例如，各群体之间的攻击性评分没有差异。反应时间降低是否反映了氧气摄取或运输能力受损仍然未知。尽管如此，这不太可能，因为我们没有检测到心率性能指标与捕食者互动变量之间有任何显著相关性。同样，反应时间变慢有可能与结扎的鱼应激反应加剧有关。然而，研究人员们评估了皮质醇水平升高对雄性小嘴黑鲈这些行为参数的影响，但得出的结论是，皮质醇水平升高在捕食者互动期间对攻击性评分没有显著影响。然而，这些研究人员没有评估首次攻击时间。

在任何一个实验处理组中，我们都没有观察到雄性黑鲈的心率性能指标与所评估的亲代抚育行为之间有任何相关性。这在很大程度上与研究人员的类似发现一致，除了一个相反的观察结果，即研究人员确实发现攻击性评分与心率范围中的常规心率百分比（R% 心率）呈正相关，而我们在任何一组中都没有观察到这一点。我们的研究之间存在这种差异的原因仍然未知，但可能与研究之间在方法上的细微差异有关，例如，本研究中的假手术 / 结扎处理本身可能影响了鱼的攻击性评分。

接受假手术组记录的常规心率和最大心率，与研究人员之前对雄性小嘴黑鲈这些指标的评估结果吻合得很好，他们也使用了 Star-Oddi 心率记录仪，并且除了假手术 / 结扎干预之外，实验方案几乎相同。然而，值得一提的是，考虑到由于育雏期时间有限，生物记录仪植入后的术后恢复时间可能比本实验允许的时间长得多（长达数周） ，我们的心率指标值可能甚至比这里报告的还要低。与我们的假设相反，鳃部 / 冠状动脉结扎对该物种的静息心率或常规心率、最大心率以及心率范围都没有影响。这与之前的观察结果形成对比，在之前的观察中，虹鳟鱼心脏的冠状动脉供应被阻断后，静息心率或常规心率大幅升高 ，这导致心率范围降低，因为与接受假手术的虹鳟鱼相比，追逐后的最大心率保持不变 。此外，升高的常规 / 静息心率可能有助于在常规 / 静止条件下维持心输出量，因为冠状动脉结扎对虹鳟鱼维持心脏每搏输出量有负面影响 。考虑到致密心肌仅占心脏总质量的约 10%，因此，阻断通过冠状动脉的血液供应仅影响该物种中一小部分心脏组织，所以结扎对这里评估的心率指标没有影响可能并不奇怪。因此，冠状动脉结扎可能对黑鲈的每搏输出量以及维持心输出量的能力只有轻微影响。虽然在这里进行的血管解剖评估（即通过向鳃下动脉注射 Microfil 铸型材料）中，没有观察到明显的额外的头部（即源于鳃部）冠状动脉供应途径，但小嘴黑鲈的致密心肌有可能从其他（例如尾部）途径获取氧气，不过这一点尚不清楚。

五、 结论与未来展望

基于我们的研究结果，我们得出结论，阻断鳃部血流，进而阻断冠状动脉血流（例如，可能因捕获后放生钓鱼导致的鳃损伤而发生），会对小嘴黑鲈的繁殖适合度产生负面影响。鱼钩类型和垂钓者经验等因素会影响鳃损伤的可能性 ，所以我们建议，努力减少垂钓过程中的鳃损伤，将减少放生鱼的亚致死后果。虽然我们观察到的现象背后的因果因素在很大程度上仍然难以捉摸，但我们的研究结果确实揭示了结扎的鱼有攻击性降低的趋势，这可能影响了鱼卵的状态和 / 或亲代抚育决策，从而增加了弃巢和鱼卵孵化失败的可能性。然而，繁殖适合度降低与雄性黑鲈心率性能指标受损无关。确实，阻断流向心脏的冠状动脉血流对这里评估的心率指标没有显著影响，这可能与在本研究考察的条件下，该物种对冠状动脉循环维持心率性能的依赖程度较低有关。这就引出了一个问题，冠状动脉循环如何使黑鲈的生理性能特征受益，以及为什么在这个物种的进化过程中它得以保留？人们常常认为，冠状动脉在非常活跃、“运动能力强” 的硬骨鱼类物种中是重要的，这些鱼类能够维持高水平的心脏功能，并且在其生活史中会面临剧烈的持续性有氧运动时期 。小嘴黑鲈可能不被认为是特别具有运动能力的鱼类物种，至少根据这个定义是这样。因此，在暴露于环境应激源期间，特别是在它们本就对能量需求很高的产卵期，冠状动脉循环可能对控制心脏和整个动物的性能变得更具影响力。例如，急性升温以及缺氧会增加心脏负荷和 / 或减少流向心脏的静脉（腔内）氧气供应 ，并且被认为是鱼类冠状动脉循环进化的重要驱动因素 。另一种目前尚未被探究的可能性（但见相关研究 ）是，长期暴露于环境升温以及 / 或缺氧会导致鱼类对冠状动脉的依赖增加，所以在更具挑战性的环境条件下，黑鲈的心脏功能可能更依赖于冠状动脉的氧气供应。最后，由于在各种鱼类物种中，致密心肌相对于心脏大小的比例与体型呈正相关 ，在同一物种内也是如此，例如虹鳟鱼 ，随着黑鲈体型增大，冠状动脉循环对于维持生理性能可能也会变得更加重要。这些可能性值得在未来进一步研究。

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